公元前333年8月底，亚力山大征服小亚细亚腹地后，立即南下进入波斯帝国在小亚细亚最后的据点西里西亚(Cilicia)。西亚总督阿萨姆(Arsames)继续深入诱敌，弃守金牛山上的险要山口，让马其顿军队轻松占领首都塔苏斯(Tarsus)。与此同时，波斯王大流士亲率领数十万军队从巴比伦出发，于9月初抵达阿曼山东侧的索克依(Sochoi)严阵以待，打算利用这里的平原地形与亚力山大决战。
位于安纳托利亚半岛东南角的波斯行西里西亚，是小亚细亚进入两河平原的门户，金牛山(Taurus Mountains)环绕西北两侧，东面是南北阿曼山脉(Amanus Ranges)，山以东是广阔的两河平原。只有两个山口可以通过阿曼山脉，一个是阿曼山口(Amanic Gate)，伊苏斯河谷位于山脉北部(Issus Valley)附近是叙利亚山口(Syrian Gate)，在阿曼山口南面约100公里处。亚力山大到达西里西亚后，感染风寒卧床不起，修养了一个多月才复元。他派帕马尼奥率部南进，控制叙利亚山口，并询问波斯军队的动向。帕马尼奥军团在叙利亚山口西侧扎营，派探马越过叙利亚山口向东调查，迅速发现驻扎在索克依的波斯大军。
亚力山大一直有料敌之前的能力，他接到帕马尼奥的报报，得出结论，大流士将从南叙利亚山口经过。10月底，亚力山将军伤病人留在伊苏斯的营地，带领大军向南行军60公里到叙利亚山口，准备利用地形阻止大流士。就在亚力山大进入叙利亚山口时，大流士从索克依挥手北上，顺利通过阿曼山口，占领了亚力山大留在伊苏斯的大营，俘获了所有受伤的士兵和物资，切断了亚力山大的后路。大流士砍掉了马其顿所有的伤病人，把他们送到亚力山大学，然后从伊苏斯南进20公里到皮纳罗河(Pinarus River)安营扎寨，严阵等待。伊苏斯战役以亚力山大陷入绝境拉开帷幕。
皮纳罗河是今天的帕亚斯河(Payas River)。这条河起源于阿曼山，全长约4公里，上游一公里以上的河段穿过山谷；进入海岸平原的原始500米只能算是一条小溪；中游近两公里的河段加宽到35米，河床上石头密布，河岸因山洪冲刷而高耸陡峭，只有几个温和的地段可以穿越；下游500米河段相对平坦开放。卡利斯蒂尼，亚力山大的史官(Callisthenes)根据记录，皮纳罗河谷平原的宽度不超过2.5公里。即使加上一个可以部署部队的平缓山坡，整个战场的宽度也不会超过3公里（目前帕亚斯河谷平原的宽度为3.5公里）。古典史料记载，大流士乘坐黄金制成的华丽战车高居波斯阵线中央，从战场上的任何地方都能看到他魁梧的身影。2000名骑兵禁卫军被大流士包围，前面排列着3000名希腊雇佣军，形成了中央阵营。由于战场狭窄，希腊雇佣军密集方阵的深度达到24行。左翼阵营由4万名卡尔达克步兵和2万名弓箭手组成，部署在步兵方阵后面。大流士特别派遣2万步兵在皮纳罗河以南依山列阵，包抄马其顿军队右翼。波斯右翼有2万名卡尔达克步兵，3万名波斯骑兵在部署后退到右翼，占据皮纳罗河下游河段。纳巴扎尼(Nabarzanes)，他的6000铁甲骑兵是大流士寄予厚望的突击部队。就这样，波斯军队在第一道防线上部署了15万人，在波斯阵线后面，还有由众多未知的藩邦部队组成的第二道防线。
大流士的排兵布置相当精明，唯一的失败就是2000马迪亚(Mardian)弓箭手部署在波斯左翼重装步兵前。马迪亚人是伊朗高原西南部的游牧民族，以其优秀的弓箭手而闻名于波斯帝国。大流士的安排可能是为了充分发挥马迪亚弓箭手快速准确的直射火力，以阻止马其顿骑兵的冲锋，但他显然高估了弓箭对马其顿重骑兵的致命性。轻型马迪亚弓箭手根本没有抗冲击能力，他们身后的卡尔达克重型步兵被安排成希腊风格的密集阵列，没有为弓箭手留下足够开放的撤退渠道。这种弱点会导致波斯左翼崩溃。
大多数后世史学家认为波斯军队的数量被夸大了。大流士的2000人应该没有水；希腊雇佣军占据的阵线宽度不到一公里。根据24行密集阵的厚度，实际兵力不得超过2万人。同理，左翼4万卡尔达克步兵和2万弓箭手的实际兵力至少要减半，即总共3万人。右翼波斯骑兵占据的战场宽度只有500米论如何，它不能容纳3万名骑兵。据估计，后人最多只有1万名波斯骑兵，其中至少一半是盔甲骑兵。据估计，波斯军队的一线部队约有7万人。
马其顿军队在大流士调兵遣将的同时，继续稳步前进，各部队在行进过程中逐步进入指定阵线。左翼阵营是帕米尼奥率领的马其顿密集阵，共1.2万重装步兵，由6个团级方阵组成。指挥官是帕米尼奥的儿子尼卡诺(Nicanor)、科恩(Coenus)、柏蒂卡(Perdiccas)、美利格(Meleager)、托勒密(Ptolemy)、和阿铭塔(Amyntas)。密集的阵列最初是32行的深度，随着战场的变宽而向两翼展开，厚度先减为16行，再减为8行，以保持足够的正宽。密集阵前面是由2000名雷斯标枪手和克里特弓箭手组成的散射线，左边是600名希腊联盟重骑兵保护侧翼。亚力山像往常一样率2000名近卫骑兵组成右翼主力，左边是3000名近卫步兵连接马其顿密集阵，右边是1800名特萨利重骑兵和800名马其顿轻骑兵，右翼远端是2000名希腊联盟游击步兵和3000名阿格里亚和色雷斯标枪手。亚力山大把希腊联盟重装步兵4千人作为预备队，大概是考虑到波斯军队里希腊雇佣军数量众多，害怕自己的希腊部队面对同胞不忍下手。马其顿共有3.2万人参战。
波斯骑兵队在大流士队布阵后迅速撤退，亚力山大终于看到了波斯队的全貌。显然，大流士和亚力山大英雄看到的略同，兵力部署左弱右强，突击部队放在右翼。面对波斯希腊雇佣军和卡尔达克步兵，马其顿的密集阵列处于一比三的军事劣势，但波斯军队显然计划在这里防守。他们在皮纳罗河北岸容易涉渡的地区埋下了大量锋利的树桩，以阻止马其顿重的冲锋。这种缺乏信心的表现使马其顿步兵士气更加旺盛。马其顿密集阵的左侧是2000名标准枪手和弓箭手，以及600名希腊重骑兵，他们面对波斯最精锐的部队 - 纳巴扎尼指挥官的铁甲骑兵实力相差很大。波斯左翼的2万卡尔达克重装步兵和1万弓箭手将接受马其顿近卫骑兵的考验，他们的任务是抵抗和拖延马其顿骑兵。在马其顿阵线右侧的山坡上，有成千上万的波斯步兵威胁着马其顿右翼阵线的后侧。
亚力山大看到马其顿左翼远端太弱，立即将右翼1800特萨利重骑兵调到左翼。在这里，亚力山大展示了高超的指挥艺术。他命令特萨利骑兵悄悄地向左移动，靠近马其顿密集阵列的后面。大流士的视线被马其顿长矛遮住，马其顿长矛像森林一样竖立，没有注意到这一动作。亚力山大没有在马其顿密集阵的左侧部署特萨利骑兵，而是让他们躲在方阵后面，接受帕米尼奥的指挥。这支奇兵在战役当中起到了非常关键的作用。接下来，亚力山大在2000名游击步兵和1000名标准枪手的支持下，派出600名近卫骑兵攻击右山坡上的波斯步兵，以消除他们对马其顿侧翼的威胁。经过短暂的战斗，波斯步兵被迫放弃缓坡上的阵地，远远地退到山麓。亚力山大随后派出300名轻骑兵留在山坡上监视警戒，将其他部队撤退。
当马其顿军队前进波斯军队的弓箭射程时，亚力山大命令军队在原地休息。像往常一样，他策马驰过马其顿阵线检阅部队，慷慨激昂地表演鼓舞士气。与此同时，波斯军队的将军们也在战前大声训练他们各自的部队进行战前动员，各种语言的呼喊在河谷中一个接一个地回响。马其顿士兵群情激昂，发出惊天动地的战吼(War Cry)，波斯阵营不甘示弱，也以海啸般的吼声回应，而成千上万的波斯战鼓开始轰鸣，震耳欲聋。伊苏斯战役一触即发。